真菌性角膜炎检查

　　诊断比较困难，必须与细菌性角膜溃疡进行鉴别。有农业性眼外伤史，典型的临床表现，是诊断的主要依据。再者，疑为真菌感染时，应作角膜病变处刮片。将取下的坏死组织放于玻片上，滴5%氢氧化钾一滴，覆盖破片，立即镜检，寻找真菌菌丝。有条件时应进行真菌培养。

　　1.刮片检查

　　(1)取材：

表面麻醉(最好应用0.5%丙氧苯卡因，因该药较其他表面麻醉剂的抑菌作用轻)后，用圆刃刀片从病灶深部或边缘刮取组织。

　　(2)染色法：

常用的方法有革兰染色法、Giemsa染色法及KOH湿片法，有时也可采用特殊真菌染色法(Gomori mefhenamine)，其染色的阳性率分别为55%、66%、33%及85%。革兰染色最为简单，真菌呈革兰阳性(深紫色)，其他组织为阴性(红色)。KOH湿片法是利用KOH溶解刮片中的非真菌杂质而显示菌丝，有报道同时加入亮绿、甲绿或墨水染色(10%氢氧化钾和墨汁以9∶1的比率混合而成的混合液)能增加对比度，光镜下可见真菌细胞壁有墨水或绿色小颗粒附着，而胶原纤维及炎性细胞则未着染，对比强烈，容易识别。缺点为易出现假阳性或假阴性。最近有人采用caleofluor-white染色(CFW染色)，此染色剂能与真菌细胞壁的壳多糖和纤维素紧密结合，在荧光显微镜下真菌显示强烈的深绿色。

　　2.真菌培养

刮片检查简单而迅速，但只能确定是真菌，而不能鉴别真菌菌种及进行药敏试验，因此，还必须进行真菌培养。常用的培养方法及培养温度如下。

　　(1)血琼脂(blood agar)，25℃及37℃下培养。

　　(2)sabouraud葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。

　　(3)马铃薯葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。

　　多数酵母菌易在血琼脂中生长，丝状菌易在sabouraud琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂生长(注意镰刀菌在37℃时，2～3天即可生长，而其他真菌在37℃时，则需要1周以上时间才能生长)。

　　3.聚合酶链反应技术

(polymerase chain reaction，PCR) 国外已有将临床分离出的真菌进行体外培养，并应用PCR技术进行分型诊断，认为PCR技术对于角膜真菌的快速诊断有良好的应用前景，但需要解决假阳性结果的问题。

　　4.应用几丁质鉴别真菌

Lamps(1995)指出几丁质是在真菌和节肢动物中含有的多糖结构，而在哺乳动物中缺乏。真菌细胞壁的几丁质成分随着菌种的不同而不同，因此具有很高的特异性，不同荧光标记的凝集素可以与不同几丁质特异性结合，发出特异荧光，以快速诊断并鉴别菌种。国外目前认为此技术为快速特异的真菌诊断手段，国内尚未见报道。

　　5.角膜活检

当刮片和培养均为阴性结果，临床仍然怀疑真菌感染时除应反复多次进行检查外，还应做角膜活检。用尖刀片切取病灶组织，或用穿透性角膜移植术钻取的病灶组织，石蜡包埋固定后作病理切片，然后染色镜检。光镜检查的染色法有：PAS染色，HE(苏木精-伊红)染色及抗酸染色等;荧光显微镜检查有吖啶橙(acridine orange)染色及CFW染色。组织学上所见：

　　(1)“菌丝苔被”

是由大量中性粒细胞浸润、角膜基质层的凝固性坏死及胶原纤维肿胀所构成，很少见到完整的真菌。

　　(2)菌丝苔被病灶周围有大量菌丝，

菌丝沿角膜板层平行蔓延，也可垂直穿通角膜小板向前向后生长，并穿过后弹力膜到达前房或后房引起炎症反应。

　　(3)“羽毛状边缘”

是圆形细胞及浆细胞浸润，并非是真菌的菌丝。

　　6.共焦显微镜(confocal microscope)

共焦显微镜是20世纪90年代中期新兴的一种活体非创伤性的角膜疾病检查方法，可以从细胞水平观察角膜的不同层次结构。已应用于HSK和棘阿米巴角膜炎的诊断。Winchester(1997)应用共焦显微镜观察曲霉菌性角膜炎，角膜中可见高清晰度的菌丝直径6微米，长60～40微米。在时间、敏感性、安全性方面，共焦显微镜都明显优于以往任何一种诊断方法。